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各省、自治区、直辖市农业农村（农牧、畜牧兽医）厅（局、委），新疆生产建设兵团农业农村局： 为提升养殖业产品质量安全水平，加快推进畜牧业绿色发展，根据《农产品质量安全法》《饲料和饲料添加剂管理条例》《兽药管理条例》《乳品质量安全监督管理条例》等法律法规规定，我部制定了《2020年全国饲料质量安全监督抽查计划》《2020年动物及动物产品兽药残留监控计划》《2020年动物源细菌耐药性监测计划》《2020年生鲜乳质量安全监测计划》。现印发给你们，请遵照执行。 附件：1.2020年全国饲料质量安全监督抽查计划 2.2020年动物及动物产品兽药残留监控计划 3.2020年动物源细菌耐药性监测计划 4.2020年生鲜乳质量安全监测计划
农业农村部
2020年2月11日 附件1
2020年全国饲料质量安全监督抽查计划
为切实强化饲料质量安全监管，我部畜牧兽医局按照“双随机、一公开”的要求，采取“互联网+饲料监管”的方式，组织开展2020年全国饲料质量安全监督抽查工作。现制定监督抽查计划如下。一、工作计划 （一）全国饲料质量安全监督抽查 全国饲料质量安全监督抽查工作分上半年和下半年2次进行，分别于2020年7月10日和11月10日前完成。 1.生产企业监督抽查。在全国饲料生产企业名录库中随机选取1000家以上饲料生产企业，抽检样品3000批次以上。 2.生产企业现场检查。在被监督抽查企业中确定300家开展《饲料质量安全管理规范》执行情况检查。 3.风险预警监测。在生产、经营和使用环节开展饲料中非法添加物预警监测，重点产品包括混合型饲料添加剂、植物提取物、植物性饲料原料、微生物制剂、酶制剂和宠物饲料等。开展微生物发酵类产品及其生产菌株的合规性调查和安全性风险分析。 （二）省级饲料质量安全监督抽查 各省级饲料管理部门负责辖区内饲料质量安全监督抽查工作。监督抽查饲料生产企业数量不低于辖区内企业总数的30%，各省份监督抽查批次数见附件1—1。随机对辖区内饲料经营门店开展监督抽查。 二、工作内容 （一）确定被监督抽查企业。我部畜牧兽医局按照“双随机”原则，通过全国饲料质量安全监测信息系统确定全国被监督抽查企业名单，每个省份数量不低于该省企业总数的15%，2019年在我部监督抽查中发现产品不合格的企业必检。 （二）采样与检测。国家饲料质量监督检验中心（北京）负责从全国饲料质量安全监管专家库中随机选取100名人员，组成工作组赴被监督抽查企业采集样品，并负责向承检机构派发检测样品。对于监督抽查样品检测结果为不合格的，各承检机构要在出具检验检测报告后48小时内（以寄出邮戳时间为准），将《不合格结果通知单》（见附件1—2）和检验检测报告通过邮政特快专递寄给被监督抽查企业和国家饲料质量监督检验中心（北京），《不合格结果通知单》同时传真至我部畜牧兽医局。样品采集、检验检测记录、检测结果及相关信息要及时录入全国饲料质量安全监测信息系统，具体要求按照我部《饲料质量安全监督抽查检测工作要求》（农牧发〔2019〕22号）执行。 （三）复核检测和仲裁检验。被监督抽查企业对检验结果有异议的，可自收到检验结果之日起5日内向我部畜牧兽医局书面申请复核检测（格式见附件1—3）。国家饲料质量监督检验中心（北京）负责派发复检样品，有关省级饲料质检机构负责检测，复检程序按照我部《饲料质量安全监督抽查检测工作要求》执行，复检结果由国家饲料质量监督检验中心（北京）告知申请复检企业。复检费用由提出复检申请的被监督抽查企业承担。 三、工作要求 （一）加强协同配合。各省级饲料管理部门和质检机构要高度重视，认真配合全国饲料质量安全监督抽查工作组在辖区内开展的相关工作。 （二）及时报送省级监测计划。各省级饲料管理部门要在2020年4月20日前，将本省级监督抽查计划报送我部畜牧兽医局，并抄送国家饲料质量监督检验中心（北京）。 （三）派员参加培训。各承检机构要选派人员参加我部畜牧兽医局组织的相关培训。各省级饲料管理部门要支持本省纳入全国饲料质量安全监管专家库的人员参加我部畜牧兽医局组织的相关培训。 （四）保障检测能力。我部畜牧兽医局委托国家饲料质量监督检验中心（北京）对承检机构的部分样品进行检测结果复核，组织开展实验室检测能力比对和检测工作质量现场检查。 （五）依法依规查处。各省农业农村行政主管部门要组织执法机构对不合格产品的生产企业进行调查，依法进行查处，并于2020年12月31日前将全年查处情况报送我部畜牧兽医局。 四、联系方式 农业农村部畜牧兽医局饲料饲草处 联系电话：010—59191800，59192848（传真） 电子邮件：xmjslch@agri.gov.cn 通讯地址：北京市朝阳区农展南里11号 国家饲料质量监督检验中心（北京） 联系电话：010—82106583、82106580（传真） 电子邮件：gjzx@caas.cn 通讯地址：北京市海淀区中关村南大街12号 附件：1—1.2020年省级饲料质量安全监督抽查任务 1—2.不合格结果通知单 1—3.样品不合格结果复检申请函（格式） 1—4.风险预警监测工作方案 1—5.检测方法 判定依据 判定原则 附件1—1 2020年省级饲料质量安全监督抽查任务
不合格结果通知单 （被监督抽查企业名称）： 根据农业农村部《2020年全国饲料质量安全监督抽查计划》要求，我单位作为承检机构对（被监督抽查企业名称）标称为 _____的_____产品进行了检验。不合格检验检测报告共____份，编号为____。如异议，可自收到报告之日起5日，向农业农村部畜牧兽医局书面提出复核检测申请（须详细注明联系方式）。微生物指标不接受复核检测申请。 承检机构名称：____________________________________ 地址： ___________________________________________ 联系人：___________ 电话（传真）： _______________ 手机：_____________ 电子邮箱： ________________ （承检机构公章） 年 月 日 注：本通知单和检验检测报告通过邮政特快专递寄给被监督抽查企业和国家饲料质量监督检验中心（北京）；同时传真（010—59192848）至我部畜牧兽医局，并电话确认（010—59191800）。 附件1—3 样品不合格结果复检申请函 农业农村部畜牧兽医局： 月 日，我 （单位名称）接到 （承检机构名称）寄送的《不合格结果通知单》和检验检测报告。现提出复核检测申请。 理由：____________________________________ 申请单位公章 年 月 日 联 系 人：_____________ 联系电话：_____________（手机、座机号码） 附件1—4 风险预警监测工作方案 为切实强化饲料质量安全监管，我部畜牧兽医局对全国饲料生产、经营和使用环节的重点饲料产品开展风险预警监测，分析评估重大潜在风险因素，为实施有效监管提供支撑。 一、工作内容 围绕混合型饲料添加剂、植物提取物、植物性饲料原料、微生物制剂、酶制剂和宠物饲料等重点产品，在重点环节有针对性地采集样品，检测筛查未知物质、违规违禁药物、禁用物质等非法添加物，评估质量安全风险。开展微生物发酵类产品及其生产菌株的合规性调查和安全性风险分析。 二、重点任务 （一）饲料中非法添加物筛查与风险预警监测。主要监测指标为未知物质、违规违禁药物和禁用物质等。由国家饲料质量监督检验中心（北京）负责制定工作方案并组织实施，中国农业科学院饲料研究所、辽宁省检验检测认证中心、上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所）、浙江省兽药饲料监察所、山东省饲料质量检验所、河南省兽药饲料监察所、湖北省饲料监测所、中国农业大学工学院等单位参与实施。 （二）混合型饲料添加剂风险预警监测。主要监测指标为主成分含量、未知物质、违规违禁药物和禁用物质等。由中国农业科学院饲料研究所负责制定工作方案并组织实施，国家饲料质量监督检验中心（北京）、上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所）、河南省兽药饲料监察所、四川省饲料工作总站、青岛市农产品质量安全中心等单位参与实施。 （三）植物提取物和植物性饲料原料风险预警监测。主要监测指标为主成分含量、未知物质、违规违禁药物和禁用物质等。由中国农业科学院饲料研究所负责制定工作方案并组织实施，国家饲料质量监督检验中心（北京）、天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所、湖南农业大学、西南民族大学、河南牧业经济学院等单位参与实施。 （四）宠物饲料产品风险预警监测。主要监测指标为宠物饲料标签、主要质量安全指标和非法添加物。由浙江大学饲料科学研究所负责制定工作方案并组织实施，全国畜牧总站、中国饲料工业协会、国家饲料质量监督检验中心（北京）、中国农业科学院饲料研究所、中国农业科学院农产品加工研究所、北京市饲料监察所等单位参与实施。 （五）生物发酵类饲料产品风险预警监测。开展菌种菌株合规性调查评估和菌株致病性、耐药性、产毒性、代谢安全性等潜在风险分析。由中国农业科学院饲料研究所、生物饲料开发国家工程研究中心负责制定工作方案并组织实施，全国畜牧总站、中国饲料工业协会、国家饲料质量监督检验中心（北京）、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、河南省兽药饲料监察所、内蒙古农业大学、江南大学、中国生物饲料产业创新战略联盟会员单位、生物饲料质量安全预警项目监测站等单位参与实施。 （六）饲料中环境污染物风险预警监测。主要监测指标为持久性环境污染物中的多氯代二苯并二噁英和多氯代二苯并呋喃、二噁英类多氯联苯和中短链氯化石蜡等。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心（北京）负责制定工作方案并组织实施。 （七）饲料质量安全风险预警监测技术平台构建。开展饲料及饲料原料中未知物质、违规违禁药物、禁用物质等非法添加物的高通量筛查及综合查询比对方法研究，上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所）、中国农业科学院饲料研究所、国家饲料质量监督检验中心（北京）负责。构建兼容不同仪器筛查库的非法添加物筛查共享谱库，开展饲料及饲料原料中多种环境污染物筛查技术研究和追溯技术研发，国家饲料质量监督检验中心（北京）负责。开展发酵饲料用菌种菌株鉴别评价技术平台的构建和常见植物主要功能性成分检测技术及质量标准化控制研究，中国农业科学院饲料研究所负责。 三、工作要求 （一）风险预警监测样品来源包括饲料生产、经营、使用环节以及网络交易平台采集或购买的样品，全国和各省级饲料质量安全监督抽查工作中采集的样品，也包括群众举报的可疑饲料样品。 （二）风险预警监测样品的检验检测报告不向被抽样单位发送。 （三）各项风险预警监测任务负责单位要及时向我部畜牧兽医局报告工作过程中发现的风险隐患，并组织专家及时研判质量安全风险，锁定问题线索。 （四）各参与实施单位在2020年11月1日前完成抽样和检测任务，并将操作规程、监测结果报送各负责单位，由任务负责单位形成工作总结报告，在2020年11月10日前以纸质文件和电子文档报送中国农业科学院饲料研究所。中国农业科学院饲料研究所在2020年12月10日前，将2020年度工作情况总结报告报送我部畜牧兽医局。 四、联系方式 农业农村部畜牧兽医局饲料饲草处 联系电话：010—59191800，59192848（传真） 电子邮件：xmjslch@agri.gov.cn 中国农业科学院饲料研究所 联系电话：010—82106058，82106069/6059（传真） 电子邮件：lijun08@caas.cn guxu@caas.cn 附件1—5 检测方法 判定依据 判定原则 本计划中涉及检测方法、判定依据和判定原则如下。 一、检测方法 GB 5009.227—2016 食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定 GB 5009.229—2016 食品安全国家标准 食品中酸价的测定 GB/T 5532—2008 动植物油脂碘值的测定 GB/T 6432—2018 饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法 GB/T 6435—2014 饲料中水分的测定 GB/T 6436—2018 饲料中钙的测定 GB/T 6437—2018 饲料中总磷的测定 分光光度法 GB/T 8381.7—2009 饲料中喹乙醇的测定 高效液相色谱法（含第1号修改单） GB/T 8381.9—2005 饲料中氯霉素的测定 气相色谱法 GB/T 21108—2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 GB/T 13079—2006 饲料中总砷的测定 GB/T 13080—2018 饲料中铅的测定 原子吸收光谱法 GB/T 13082—1991 饲料中镉的测定方法 GB/T 13088—2006 饲料中铬的测定 GB/T 13091—2018 饲料中沙门氏菌的测定 GB/T 13885—2017 动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法 GB/T 14701—2019 饲料中维生素B2的测定 GB/T 14702—2018 添加剂预混合饲料中维生素B6的测定 高效液相色谱法 GB/T 17817—2010 饲料中维生素A的测定 高效液相色谱法 GB/T 17812—2008 饲料中维生素E的测定 高效液相色谱法 GB/T 17818—2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 GB/T 18246—2000 饲料中氨基酸的测定（2020年7月1日前适用） GB/T 18246—2019 饲料中氨基酸的测定（2020年7月1日后适用） GB/T 19164—2003 鱼粉（附录A鱼粉中砂分的测定方法） GB/T 19684—2005 饲料中金霉素的测定 高效液相色谱法 GB/T 20190—2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法 GB/T 22259—2008 饲料中土霉素的测定 高效液相色谱法 GB/T 23710—2009 饲料中甜菜碱的测定 离子色谱法 GB/T 30956—2014 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化—高效液相色谱法 GB/T 30957—2014 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化—高效液相色谱法 农业部1486号公告—8—2010 饲料中硝基呋喃类药物的测定 高效液相色谱法 农业部1629号公告—1—2011 饲料中16种β—受体激动剂的测定 液相色谱—串联质谱法 农业部2086号公告—5—2014 饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定 液相色谱—串联质谱法 农业部2483号公告—8—2016 饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的测定 液相色谱—串联质谱法 NY/T 1372—2007 饲料中三聚氰胺的测定 NY/T 1946—2010 饲料中牛羊源性成分检测 实时荧光聚合酶链反应法 NY/T 1970—2010 饲料中伏马毒素的测定 NY/T 2071—2011 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T—2毒素的测定 液相色谱—串联质谱法 NY/T 3144—2017 饲料原料血液制品中18种β—受体激动剂的测定 液相色谱—串联质谱法 NY/T 3145—2017 饲料中22种β—受体激动剂的测定 液相色谱—串联质谱法 饲料添加剂主含量的检测方法：采用相应饲料添加剂产品标准中规定或推荐的检测方法。 二、判定依据 （一）卫生指标。按照《饲料卫生标准》（GB 13078-2017）判定；饲料添加剂产品按照生产企业产品执行标准判定。 （二）质量指标。按照生产企业产品执行标准、有效合同、明示指标（饲料标签的明示指标、产品说明）进行判定。如生产企业产品执行标准与明示指标、《饲料添加剂安全使用规范》（农业部公告第2625号）不一致，以其中较严格指标进行判定。 （三）药物饲料添加剂和非法添加物。《饲料和饲料添加剂管理条例》《兽药管理条例》《禁止在饲料和动物饮水中使用的药物品种目录》（农业部公告第176号）、《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》（农业部公告第1519号）、《关于停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂的公告》（农业农村部公告第194号）、《关于相关兽药产品质量标准修订和批准文号变更的公告》（农业农村部公告第246号）、《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》（农业农村部公告第250号）、《饲料原料和饲料产品中三聚氰胺限量值的规定》（农业部公告第1218号）。 （四）饲料和饲料添加剂产品标签中分析保证值之外的指标判定不考虑产品的保质期。 三、判定原则 （一）单项指标判定。饲料产品的各类质量指标及其卫生指标依据《饲料检测结果判定的允许误差》（GB/T 18823—2010）执行。 1.饲料添加剂的判定。各类质量指标及其卫生指标不考虑方法误差。 2.药物饲料添加剂判定。对于2020年7月1日之前生产的饲料产品，在规定范围内使用的药物饲料添加剂，以折算回收率后的结果进行判定，超出规定添加量的，判定为不合格；对于超范围使用的药物饲料添加剂，以检测方法的定量限或最低检出浓度为判定限，超过判定限即判定为不合格。对于2020年7月1日之后生产的饲料产品中的药物饲料添加剂，确认检测方法有定量限的以定量限为判定限，超过定量限即判定为不合格；没有定量限的，以检测限或检出限为判定限，超过检测限（检出限）即判定为不合格。 3.非法添加物的判定。确认检测方法有定量限的以定量限为判定限，超过定量限即判定为不合格；没有定量限的，以检测限或检出限为判定限，超过检测限即判定为不合格。三聚氰胺的判定按照《饲料原料和饲料产品中三聚氰胺限量值的规定》（农业部公告第1218号）判定。 4.牛羊源性成分判定。牛源性成分、羊源性成分有一项为阳性（高于0.25%的检出限），则判定该样品为不合格。使用实时荧光PCR方法时，设置0.25%的阳性对照样，以实测Ct值进行阳性或阴性判定。 （二）产品综合判定。一项指标不合格即判定该批次产品不合格。水分仅作计算使用，不纳入综合判定。 附件2
2020年动物及动物产品兽药残留监控计划
为加强兽药残留监控，促进养殖环节科学安全合理用药，保障动物源性食品安全，我部畜牧兽医局制定了《2020年动物及动物产品兽药残留监控计划》（以下简称《监控计划》）如下。一、组织实施 我部畜牧兽医局负责全国动物及动物产品兽药残留监控计划的组织实施工作。各省级兽医行政管理部门负责组织开展辖区畜禽产品兽药残留监控工作。在配合完成国家监控计划的同时，应制定并组织实施辖区兽药残留监控计划，监控数量不得低于国家计划的20%。部属有关事业单位、可承接政府购买服务的部分省级兽药检验机构和第三方检测机构，按照《监控计划》承担相关检测任务。 二、抽检要求 （一）各省级兽医行政管理部门组织做好辖区内畜禽及其产品抽样工作，安排官方取样人员进行采样，并在抽样单上签字。承担检测任务的机构应支付样品购买等相关费用，与官方抽样人员做好样品交接手续，并可根据需要派员赴采样现场协助官方取样人员采样。 （二）抽检活动严格执行《官方取样程序》和《2020年动物及动物产品兽药残留抽样和检测技术操作要点》（以下简称《操作要点》），并按要求填报抽样信息。 （三）畜禽产品样品原则上应从动物养殖和屠宰环节抽取。牛奶样品从奶牛养殖场（户）、生鲜乳收购站抽取。开展鸡肉、鸡肝以及鸡蛋中违规用药检测的，从养殖场抽取的样品数量应超过抽样总数的三分之一。 （四）科学确定抽样方式。按照两个时段（6月底前为第一时段，7月至10底为第二时段），均匀抽样，不得在某一时段集中抽样。除后续跟踪抽样外，不应对同一采样点重复抽样。 （五）兽药残留检测按照《2020年度动物及动物产品兽药残留检测方法及残留限量》执行，确证方法按照食品安全国家标准、我部发布或指定的方法、参照国际公认的方法执行。各检测机构不得擅自变更检测方法和检测限。确需调整本计划确定的检测限、检测方法的，应事先向全国兽药残留和耐药性控制专家委员会办公室（以下简称残留办）提交申请材料，经核准后再进行检测。 （六）对于已发布过确证方法并以筛选方法或定量方法检测出的阳性样品，应进一步进行确证检测，以确证检测结果作为上报数据。 （七）各检测机构要严格执行检测结果报告制度，按要求填报检测结果汇总表。 （八）各检测机构要严格执行阳性（超标）样品报告制度。在检测出阳性样品后的10个工作日内将检测报告送抽样单位（官方取样人员所在单位）、所在地市县及省级畜牧兽医行政管理部门。省级畜牧兽医行政管理部门及时启动后续跟踪抽样、检测程序，抽样比例为1:5，即每发现一份阳性样品，对被抽样单位连续跟踪抽样2次，每次5份样品。后续跟踪抽样检测样品数列入辖区残留监控计划，获得结果后按要求填报表格。 三、结果处理 各地要进一步强化残留超标产品的后续处理，省级兽医行政管理部门要做好跟踪督办，样品来源所在地兽医行政管理部门接到检测机构反馈的残留超标检测报告后，按《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》（农牧发〔1999〕8号）启动追溯程序。 （一）根据残留超标样品反馈信息溯源动物养殖场，对养殖场用药情况进行核查，重点检查兽医处方、用药记录和库存兽药产品。 （二）发现养殖用药不规范，未执行休药期等问题要及时提出改正措施，并监督整改。依据《兽药管理条例》有关规定，对使用了禁用药物及其他化合物的动物及其产品要监督养殖场和屠宰企业进行无害化处理。 （三）发现假劣、禁用药物及其他化合物要清缴销毁，及时报告本地省级兽医行政管理部门，同时通报标称兽药生产企业所在地省级兽医行政管理部门，依法严肃查处违法违规行为。对符合农业农村部公告第97号从重处罚的情形，应依法对相关兽药生产企业、经营企业予以从重处罚。 （四）残留超标样品处理结果要及时报省级畜牧兽医行政管理部门，并做好调查处理记录，记录存档2年以上。 四、工作要求 （一）承担抽样和检测任务的单位要密切配合，及时沟通情况，按照《操作要点》完成检测样品的抽样、登记、保存、交接和检测工作。 （二）承担检测任务单位于2020年7月15日和11月 15日前将检测结果分析报告和相关表格的纸质材料和电子版分次报残留办。 （三）残留办负责兽药残留检测结果汇总和监控计划执行情况的总结上报工作。阶段性工作总结和全年工作总结分别于2020年7月31日和12月10日前报我部畜牧兽医局。 （四）我部将对畜禽及畜禽产品、蜂产品兽药残留监测情况进行通报，并对及时报送检测结果、对残留超标样品开展并予以处罚的省份通报表扬。 （五）各地要将工作中存在的问题和建议及时反馈我部畜牧兽医局和残留办。 附件：2–1.2020年动物及动物产品兽药残留监控计划 2–2.2020年动物及动物产品兽药残留监控计划各省份任务分工表 2–3.2020年动物及动物产品兽药残留抽样和检测技术操作要点 2–4.2020年动物及动物产品抽样情况、检测结果和跟踪检测结果汇总表 2–5.2020年度动物及动物产品兽药残留检测方法及残留限量 附件 2–1 2020 年动物及动物产品兽药残留监控计划 1. 畜禽产品部分
2.蜂产品部分
2020 年动物及动物产品兽药残留监控计划各省份任务分工表
附件 2–3 2020 年动物及动物产品兽药残留抽样和检测技术操作要点 1.2020年残留监控计划分为2个时段执行，6月底前为第一时段，7月至10月底为第二时段。要严格执行本时段抽样、本时段检测的总体要求，不得采取全年监控计划集中在一个时段完成或一次抽样、集中或分时段检测的做法。 2.监控计划抽样数量、检测品种必须按照下达的计划执行。 3.抽样办法 3.1畜禽产品抽样 3.1.1养殖场抽样（尿样、蛋、奶） 3.1.1.1根据动物饲养基数计算抽样数量，进行鸡、鸡蛋、尿液中化合物检测的，必须至少有三分之一的样品来源于养殖场。 猪尿样 动物数量（样本数）抽样数（个） <500 3 501–1000 7 1001–5000 10 5001–10000 12 >10000 15 牛奶 动物数量（样本数） 抽样数（个） <50 5 51–100 8 101–500 12 >500 15 家禽（蛋） 动物数量（样本数，只） 抽样数（个） <1000 1 1001–5000 3 5001–10000 5 >10000 8 3.1.1.2一个样品的组成及取样量尿样 收集清晨饲喂前的尿液 100–200 ml。 初级产品 蛋：从产蛋架上抽取，取样量不少于 10 枚； 奶：从全场混合奶中取，取样量不少于 1000 ml。 3.1.2屠宰厂抽样（动物组织） 3.1.2.1根据屠宰动物数计算抽样个数方法 家畜（猪、羊、牛） 屠宰量（样本数，头） 抽样数（个） <100 5 101–500 8 501–2000 10 >2000 15 家禽（鸡） 屠宰量（样本数，只） 抽样数（个） <1000 1 1001–5000 3 5001–10000 5 >10000 8 3.1.2.2一个组织样品的组成如下表
3.1.4样品分割：抽样后要求由官方兽医人员或官方兽医人员协助检验机构采样人员，现场将样品分成两份，一份送检，一份由被抽样单位留存。 3.1.5样品包装：用清洁干燥的塑料袋包装，外附标签，放入塑料盒内后用胶带密封，在盒外贴上抽样封条，再用塑料袋密封（标签和抽样封条应按规定内容填写，并加盖抽样单位公章）。样品包装， 标签和封条要统一。 3.1.6样品保存：取样过程中应采取低温保存措施，取样后应立即将样品放在-20°C 以下保存。 3.1.7送样：将样品盒放入干净容器（如硬纸板箱、塑料泡沫箱） 中密封装运，并采取保温措施（温度控制在 0–5°C），填写送样单一并送检。 3.2 蜂蜜抽样：蜂产品抽样由检测单位承担。70%样品从蜂蜜加工厂抽取，30%样品从蜂场抽取，每个样品量为 1000 克。抽样时间由承担检测任务单位根据蜂蜜生产情况确定，样品流转程序参照本办法执行。 4.抽样单填写说明 样品编号：格式为[动物品种代码]/[样品种类代码]/[抽样日期]。 代码如下：
样品名称：所取样品的种类及部位。例：全肝，背脊肉等。 动物品种：所取样品动物的名称。 年 龄：牛、羊按年计，猪按月计，鸡按日计。 抽样基数：抽样当天的出栏率（养殖场）、屠宰量（屠宰厂）、存货量（冷库）。 样本数量：所取样品的重量或体积。 批 号：样品所在批的批号，若无，则填“无”。 保存情况：运输前所采取的保存方式、保存温度及持续时间。封装情况：样品在运输过程中所采用的大容器封装。 运输情况：所采用的样品运输方式和运输过程中的温度及持续时间。 5.送样单填写说明 送样单编号：由检测机构根据本单位当年残留监控抽样任务来编号，一个样品一份送样单，编号格式为[邮政编码前 4 位]年月日序号， 如北京 2018 年 8 月 10 日送出的第 6 份样，则送样单编号为[1000]2018/08/10/06。 样品编号：同抽样单中的编号。样品名称：同抽样单中的内容。 样品数量：所取样品的重量或体积。 包封情况：指包装单个样品用的容器（盒、塑料袋）。保存情况：同抽样单中的内容。 运输情况：同抽样单中的内容。 检验项目：指要检测残留的药物品种。 6.样品流转程序 6.1取样人员抽取样品并将所取样品分成 2 份，1 份样品留被抽样单位保存，1份样品送检，并填写抽样单一式三份，官方取样人员在抽样单上签字后，分别由检测机构、被抽样单位（随留样保存）和官方取样人员所在单位保存。 6.2附有抽样单的样品由检测机构采样人员带回检测机构。 6.3检验机构业务管理部门收样后填写样品入库单并保存样品，再将样品重新编号送检验室检验（随抽样单），检测室收样后由室负责人安排检测，检验员应在接样后 15 天内完成检测，并填写检验记录。检测采用双盲法，即检验员不得知道样品的来源地和样品编号。 6.4检验室出具原始报告到检验机构业务管理部门，由检验机构业务管理部门最后出具检验结果汇总表，报残留办。 7.检验标准：执行食品安全国家标准。无国家标准的，执行我部发布、指定的方法或国际公认的方法。 8.检测技术参数的考核：在检测样品之前一定要进行技术参数考核试验。外标法要进行标准曲线（一般要求 5–6 个浓度，并且要覆盖 1/2MRL，MRL，2MRL），回收率试验（设立 1/2MRL，MRL，2MRL3 个浓度）和变异系数测定（一般要重复 3–5 次回收率试验），得到在本试验室操作条件下的各项参数，以后检样时只设 1 个阳性添加进行考察即可。对有残留限量的药物在计算检测结果时，要按平均回收率折算（本检测实验室获得的平均回收率），对于禁用药物则不必折算。内标法也要进行回收率和变异系数考察。检测时必须设立阴性和阳性添加对照组。 9.检测报告制度 9.1检验员向检验机构业务管理部门出具每一份样品的检验报告， 并应附残留量计算方法。 9.2检验机构应负责残留检测结果分析报告和检验结果汇总表编制工作。其中检测结果分析报告应包括国家兽药残留监控计划和辖区计划执行情况、残留超标样品来源分析、存在问题和建议等。检验结果汇总表 “检测结果”一栏应有两种填写方式：未检出的（低于检测限），以 ND 表示；检出残留物质的，需填写具体检测数据。检测结果汇总一律采用 A4 纸横排打印。 9.3检测阳性结果必须在 10 个工作日内报送被抽样单位所在省畜牧兽医行政管理部门和残留办，由被抽样单位所在省畜牧兽医行政管理部门组织跟踪调查处理，书面调查处理意见需报残留办备案。 9.4检测分析报告和检测结果汇总表纸质材料和电子件分两次报残留办。 附件 2–4 2020 年动物及动物产品抽样情况、检测结果和跟踪检测结果汇总表 表一 兽药残留监控计划抽样情况汇总表（2020 年度第×时段）
表二 兽药残留监控计划检测结果汇总表（2020 年度第×时段）
表三 兽药残留监控计划阳性样品追踪检测结果汇总表（2020 年度第×时段）
附件 2–5
兽药残留检测方法及残留限量
1. 畜禽产品部分
2. 蜂产品部分
附件3
2020年动物源细菌耐药性监测计划
根据《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020年）》部署和要求，为做好2020年动物源细菌耐药性监测工作，充分发挥监测工作的支撑作用，促进养殖环节科学合理用药，制定本计划。一、任务分工 （一）农业农村部畜牧兽医局负责组织开展全国动物源细菌耐药性监测工作，制定发布监测计划，分析和应用监测结果。 （二）中国兽医药品监察所（以下简称中监所）负责全国动物源细菌耐药性监测工作的技术指导、数据库建设与维护工作、药敏试验板的设计与质量控制、监测结果的汇总和分析。 （三）省级兽医行政管理部门负责配合完成全国动物源细菌耐药性监测工作相关任务，协助任务承担单位做好动物屠宰场和养殖场的采样任务。有条件的省份应积极安排检测经费，制定并组织实施本辖区动物源细菌耐药性监测计划。 （四）监测任务承担单位按要求完成全国动物源细菌耐药性监测工作计划任务。监测数量见附件3—1。 （五）各菌株保藏与鉴定单位中，中监所负责对各地耐药性监测任务承担单位分离的人畜共患病原菌（沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）菌种的保存，并指导各任务承担单位进行沙门氏菌血清分型，沙门氏菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定；中国农业大学负责肠球菌、弯曲杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定；华南农业大学负责大肠杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定；华中农业大学负责副猪嗜血杆菌和魏氏梭菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定；西北农林科技大学负责伪结核棒状杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定。 二、检测范围与原则 动物源细菌耐药性监测区域覆盖除西藏外的30个省（区、市），实行定点监测和随机监测相结合。2020年增加了2019年全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场（目录见附件3—2）作为定点监测场，并要求继续跟踪监测2018年全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场和监测网中长期定点监测的养殖场，还需随机监测责任区域内的至少3个地市，每市至少3个养殖场或屠宰场。 （一）监测大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌等3种革兰氏阴性菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹16种抗菌药的耐药性。 （二）监测肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌等4种革兰氏阳性菌对青霉素、阿莫西林/克拉维酸、红霉素、克林霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢西丁、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、万古霉素、多西环素、氟苯尼考、苯唑西林、庆大霉素、泰妙菌素、替米考星、利奈唑胺18种抗菌药的耐药性。 （三）监测弯曲杆菌对阿奇霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素9种抗菌药的耐药性。 （四）监测肠球菌和魏氏梭菌对四环素、吉他霉素、黄霉素、恩拉霉素、喹烯酮、那西肽、阿维拉霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽9种抗菌药的耐药性。 三、监测要求 （一）各监测任务承担单位要按照《动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点》（见附件3—3）开展采样、细菌分离和鉴定、耐药性检测和结果上报等工作。对于判定为万古霉素、美罗培南耐药的监测结果，相应承担单位上报监测数据之前，需对相应菌株耐药性检测结果进行复核。 （二）样品应从养殖场（包括养鸡场、养鸭场、养猪场、养羊场、奶牛场）或屠宰厂抽取。从养殖场抽样的，规模场和规模以下场各占约50%。 （三）采样的同时，应做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》（见附件3—4）。对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分开填写采样表。 （四）细菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》（附件3—5）或参照相关国际标准执行。 （五）各任务承担单位进行药敏试验时应使用经过质量认证的检测板。2020年继续监测肠球菌和魏氏梭菌对促生长用抗菌药物的耐药性。药敏试验检测板（MIC测定）使用方法见附件3—6。 四、结果报送 （一）登陆中国兽药信息网（www.ivdc.org.cn），在中国兽药数据库下选择“兽药耐药性监测数据库系统”，输入本单位用户名和密码，将经实验室相关负责人审核通过的耐药性检测数据上传到数据库，然后进行总结分析。 （二）按照任务分工，各监测任务承担单位的电子版总结在2020年10月31日之前报中监所。2021年1月31日前，由中监所完成汇总分析后报我部畜牧兽医局。 附件3—1
2020年动物源细菌耐药性监测计划
1.养殖场采样主要来自出栏前动物；对于大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌，不同养殖阶段或相同阶段不同圈舍采集的样品分离得到的菌株，可视为不同菌株；相同阶段相同圈舍采集的菌株视为同一菌株。对于沙门氏菌，同一养殖场不超过5株（最好来自不同圈舍或不同养殖阶段）。 2.样本来源涉及的养殖场规模要求大、中小型养殖场各半。 3.根据不同采样地区和动物种类，菌株数量尽量均衡分配，覆盖农业农村部发布的2018年、2019年全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场。 4.屠宰场采样中，来自同一养殖场分离的菌株不超过3株。 附件3—2 全国定点跟踪监测养殖场名录 （2019年全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场名单）
动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点 一、采样安排 （一）采样地点选择 各监测任务承担单位按照《监测计划》进行选场、采样和分离细菌。同时，负责对本省内设立的全国定点监测场（见下表）长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药性变化趋势。 （二）采样类型 病死动物采集临床病料分离动物病原菌；健康动物采集泄殖腔或盲肠拭子分离大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯曲杆菌；采集新鲜牛奶分离金黄色葡萄球菌。根据养殖场规模，每个场采样30~50份。 （三）监测的细菌种类 包括大肠杆菌、肠球菌（分为屎肠球菌和粪肠球菌）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌（分为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌）、魏氏梭菌、伪结核棒状杆菌、副猪嗜血杆菌等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地分离情况进行监测。 二、调查和记录 各监测任务承担单位要认真做好饲料和饲料药物添加剂来源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查（预防用药和治疗用药）和采集样品的统计，据实填写采样记录表。 三、细菌分离与鉴定 采用选择性培养基，定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌分离，用生化试验、PCR技术或血清学方法对分离物进行鉴定。本年度分离监测的细菌种类与数量要求见《监测计划》。分离到的菌株在-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或用其它合适方法自行保存，沙门氏菌和弯曲杆菌送中国兽医药品监察所进行血清型鉴定后保存。 四、药物敏感性测定 用经中国兽医药品监察所质量认定的药敏试验板进行药物敏感性检测。目前已进行质量认定的药敏板生产企业有：天津市金章科技发展有限公司和上海星百生物技术有限公司。检测用质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。 附件3—4
采样记录表
采 样 地： 养 殖 场： 采样时间： 联系人姓名、电话：
附件3—5 动物源细菌分离和鉴定方法 一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定方法 1 范围 本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法。 本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。 2.1 冰箱：2℃～4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：36℃±1℃。 2.3 电子天平：感量0.1g。 2.4 显微镜：10×～100×。 2.5 生物安全柜。 2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条。 2.7 采样管或商品化采样棉拭子。 2.8 微量加样器：1μL～1000μL。 2.9 吸头（与微量加样器匹配）。 3 培养基和试剂 3.1 运送培养基。 3.2 麦康凯琼脂。 3.3 大肠杆菌阳性血清。 4 大肠杆菌分离与鉴定程序 大肠杆菌分离与鉴定程序见图1。  图1：大肠杆菌分离与鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。 5.2 大肠杆菌的分离 5.2.1 拭子接种于麦康凯琼脂平板，36±1℃培养18～24h。 5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，麦康凯琼脂纯化一代。 5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36±1℃培养16～18h，待进一步细菌鉴定。 5.3 大肠杆菌的鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化试条进行生化鉴定。 必要时，采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。 二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定方法 1范围 本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法。 本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。 2.1 冰箱：2℃～4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。 2.3 电子天平：感量0.1g。 2.4 显微镜：10×～100×。 2.5 生物安全柜。 2.6 恒温水浴锅：37℃～100℃。 2.7 PCR仪。 2.8 电泳仪。 2.9 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。 2.10 冷冻离心机。 2.11 采样管或商品化采样拭子。 2.12 小型离心管。 2.13 微量加样器：1μL～1000μL。 2.14 吸头（与微量加样器匹配）。 2.15 漩涡仪。 2.16 微波炉。 3 培养基和试剂 3.1 标准菌株：沙门氏菌CVCC 541 3.2 DNA Maker 3.3 Taq DNA 聚合酶 3.4 dNTP 3.5 琼脂糖 3.6 5×TBE缓冲液 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 54.0g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA（pH8.0） 20mL 加纯净水至 1000mL 3.7 50×TAE buffer 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242g NA2EDTA.2H2O 37.2g 醋酸 57.1ml 加纯净水至 1000mL 3.8 invA基因引物 上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′ 下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′ 3.9 运送培养基。 3.11 沙门氏菌显色琼脂。 3.12 沙门氏菌阳性血清。 3.13 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）。 3.14 四硫磺酸盐增菌液（TTB）。 3.15 核酸染料。 3.16 氯化钠。 4 沙门氏菌分离与鉴定程序 沙门氏菌分离与鉴定程序见图2。  图2 沙门氏菌的分离和鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔（肛门）样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。 5.2 沙门氏菌的分离 5.2.1 将拭子置于SC增菌液，36℃±1℃培养18～24h 或TTB增菌液，42℃±1℃培养22～24h。 5.2.2 将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，36℃±1℃培养22～24h。 5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，36℃±1℃培养16～24h，待进一步细菌鉴定。 5.3 沙门氏菌的鉴定 5.3.1 生化鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，或者通过5.3.2的方法进行分子生物学（PCR）鉴定。 必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。 5.3.2 PCR法鉴定 5.3.2.1 PCR模板的制备 用接种环从营养琼脂上挑选16～24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。 5.3.2.2 PCR反应体系的配制 根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度约284bp。 5.3.2.3 PCR反应条件 95℃预变性5min，94℃变性30s, 64℃退火30s，72℃延伸30s, 30个循环，最后72℃延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。 5.3.2.4 电泳 5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液淹没胶面。 5.3.2.4.2 加样 取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。 5.3.2.4.3 电泳条件 电压110V，电泳时间30min。 5.3.2.5 结果判定 电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。 如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。 三、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定方法 1 范围 本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。 本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：0℃～4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：36℃±1℃和42℃。 2.3 显微镜：10×～100×。 2.4 商品化或自制采样管。 2.5 无菌离心管 2.6 离心机。 2.8 商品化试条或微生物鉴定仪。 3 培养基和试剂 3.1 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213 3.2 显色培养基 3.3 7.5%氯化钠肉汤10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 3.4 营养肉汤或BHI肉汤 3.5 营养琼脂 3.6 新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆 3.7 0.3%过氧化氢液 3.8 0.85%无菌生理盐水 4 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。  图3 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 5.1.1牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0℃～4℃保存，不超过48h。 5.1.2扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0℃～4℃保存不超过48h。 5.1.3 吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。 5.2 增菌和分离培养 5.2.1 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。 5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 36℃±1℃培养24～48h。 5.2.3 挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。 5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定 5.3.1生化鉴定 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。 将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5mL灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作，37℃培养18～24h后判读结果。 5.3.2血浆凝固酶试验法 挑取显色平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板，36℃±1℃培养18～24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。 新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL,溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 (或以3000r/min 离心30 min)，使血液细胞下降，即可得血浆。 取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2～0.3 mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定方法 1 范围 本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。 本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。 2.1 采样管 2.2 采样棉拭子 2.3 生物安全柜 2.4 恒温培养箱: 25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃。 2.5 恒温水浴锅：37℃～100℃。 2.6 微需氧条件：5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气，或商品化微需氧包。 2.7 显微镜：10×～100×。 2.8 微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条 2.9 高速冷冻离心机：≥12000r/min。 2.10 小型离心管：1.5mL。 2.11 微量加样器：1μL～1000μL。 2.12 吸头（与微量加样器相匹配） 2.13 PCR仪 2.14 微波炉 2.15 电泳仪 2.16 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪） 3 培养基和试剂 3.1 质控菌株：空肠弯曲杆菌标准菌株（ATCC 33560） 3.2 DNA Marker 3.3 引物及扩增片段长度 3.3.1 引物 空肠弯曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’，下游 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’，扩增片段长度为 773bp。 结肠弯曲杆菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，扩增片段长度为364bp。 3.4 运送培养基 3.5 弯曲菌选择性（CCD）培养基 3.6 哥伦比亚血琼脂培养基 3.7 生理盐水 3.8 10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ 3.9 氯化镁溶液（25mM） 3.10 Taq 聚合酶（0.5U/μL） 3.11 dNTPs（2mM） 3.12 琼脂糖 3.13 50×TAE缓冲液：将242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5M EDTA（pH8.0），加纯水至1000mL。 1×TAE缓冲液： 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。 3.14 上样缓冲液 3.15 溴化乙锭溶液（10mg/mL）：称取1g溴化乙锭溶于100mL水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。 3.16 矿物油 4 空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序 空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。  图4 弯曲杆菌的分离和鉴定程序 5 操作步骤 5.1 分离与纯化 5.1.1 分离 将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。 5.1.2 培养 将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h～48h。 5.1.3 纯化 观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。 5.2鉴定 5.2.1生化鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，并进行结果判定。或者通过5.1～5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。 5.2.2 分子生物学（PCR）鉴定 用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5mL生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷却5min后，12000r/min(4℃)离心2min，取上清作为PCR模板。 5.2.2.1 PCR反应体系 根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。 5.2.2.2 PCR反应条件 采用的PCR反应条件见下表。 PCR反应程序表
5.2.2.3.1 1.0%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.0g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）中。加热融化后加5μL（10mg/mL）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）淹没胶面。 5.2.2.3.2 加样 取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物各1孔作为对照。 5.2.2.3.3 电泳条件 电压110V，电泳时间40min。 5.2.2.4 结果判定 电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。 如果某一待检样品扩增产物的条带与空肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为空肠弯曲杆菌；如果与结肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为结肠弯曲杆菌； 必要时，可以通过测序来进一步确证。 五、 动物源屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定方法 1 范围 本方法规定了用于动物源屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定的方法。 本方法适用于各种动物中屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。 2.1 冰箱：2℃～4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：36℃±1℃。 2.3 电子天平：感量0.1g。 2.4 显微镜：10×～100×。 2.5 生物安全柜。 2.6 生化鉴定卡或商品化试条。 2.7 采样管或商品化采样棉拭子。 2.8 微量加样器：1μL～1000μL。 2.9 吸头（与微量加样器匹配）。 3 培养基和试剂 3.1 运送培养基。 3.2 肠球菌显色培养基。 4 屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序 屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序见图5。  图5 屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。 5.2 屎肠球菌和粪肠球菌的分离 5.2.1 拭子接种于肠球菌显色琼脂平板，36℃±1℃培养18～24h； 5.2.2 挑取红色至紫红色的可疑菌落，显色琼脂上纯化一代， 5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36℃±1℃培养16～18h，待进一步细菌鉴定。 5.3 屎肠球菌和粪肠球菌的鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化试条进行生化鉴定、判定结果。 必要时，采用肠球菌标准血清进行血清型鉴定。 六、动物源魏氏梭菌分离与鉴定方法 1 范围 本方法规定了畜禽源魏氏梭菌（Clostridium perfringens）的分离与鉴定。 本方法适用于畜禽源魏氏梭菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 需要的主要设备和材料如下： 2.1 商品化采样管或采样棉签； 2.2 普通冰箱：2 ℃～4℃和-20℃； 2.3 超低温冰箱：-80℃； 2.4 恒温培养箱：37℃； 2.5 恒温水浴锅：37℃～100℃； 2.6 生物安全柜； 2.7 天平：感量0.1 g； 2.8 显微镜：10×～100×； 2.9 微量加样器及吸头：1μL-1000μL； 2.10接种环或接种针； 2.11 离心管：2mL，5mL； 2.12 试管：18mm×180mm； 2.13 培养皿：直径60 mm，直径90 mm； 2.14 厌氧气罐：用于厌氧工作站，气体成分：88%N2，7%H2，5%CO2； 2.15 密封培养罐； 2.16厌氧产气袋：用于密封罐，可吸收罐中的全部O2，同时产生约21%的CO2； 2.17 厌氧工作站； 2.18 PCR仪； 2.19 微波炉； 2.20 电泳仪； 2.21 电泳凝胶成像分析系统。 3 培养基和试剂 3.1 运送培养基 3.2 液体硫乙醇酸盐培养基（FTG） 3.3 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂 3.4 脑心浸液（BHI）琼脂 3.5 绵羊血琼脂平板 3.6 P-15B D-环丝氨酸 3.7 灭菌液体石蜡 3.8 无菌生理盐水 3.9 缓冲动力-硝酸盐培养基 3.10 硝酸盐还原试剂 3.11 乳糖-明胶培养基 3.12 含铁牛乳培养基 3.14 革兰氏染色液 3.15 硝酸盐还原试剂 试剂甲：对氨基苯磺酸溶液，试剂乙：α-萘酚乙酸溶液。 3.16 商品化细菌DNA提取试剂盒 3.17 质控菌株：粪肠球菌 ATCC29212，金黄色葡萄球菌 ATCC29213 3.18 DNA Marker（2000bp） 3.19 Taq DNA 聚合酶 3.20 dNTPs 3.21 琼脂糖 3.22 50×TAE缓冲液 242g三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5M EDTA(pH8.0)，加纯水至1000mL 3.23 1×TAE缓冲液 临时用是将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。 3.24 核酸染料 3.25 16S rDNA通用引物（预期扩增子大小为1500bp） 上游为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA 下游为1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT 4 魏氏梭菌的分离与鉴定程序  图6 魏氏梭菌分离与鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 5.1.1 肛拭子或泄殖腔拭子：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的健康畜/禽或发病畜/禽个体，用无菌棉签插入其肛门或泄殖腔采集粪便，采集的健康畜/禽与发病畜/禽的样品比例为1:1，置于运送培养基。 5.1.2 粪便样品：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的健康畜/禽或发病畜/禽，用无菌棉签蘸取其排泄的新鲜粪便（用灭菌镊子扒开粪便表皮，蘸取内部粪便），置于运送培养基。 5.1.3 肠道内容物：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的屠宰或剖检畜/禽，无菌剪取其正常/异常肠段（盲肠或结肠段），结扎后置于无菌自封袋。 5.1.4 将上述采集的样品，做好标注后立即置于带有冰袋的保温设备中，转运至试验室（转运时间不超过48h）。 5.2 增菌和分离纯化 5.2.1 增菌培养 （1）棉拭子和粪便样品：从盛有样品的运送培养基中吸取液体200μL，放入含2mL FTG的5mL离心管中，加入灭菌液体石蜡封住液面，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h进行增菌； （2）肠道内容物：无菌剪开肠段，用接种环刮取内容物， 放入含2mL FTG的5mL离心管中混匀，用石蜡封住液面，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h进行增菌。 5.2.2分离纯化 吸取增菌液1mL放入90mm无菌平皿内，每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC 15 mL，混匀。琼脂凝固后，再加10 mL 冷却至50 ℃的TSC均匀覆盖于表层。待琼脂再次凝固后，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。挑取黑色且有乳白色晕圈的单菌落接种于绵羊血琼脂平板上，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，挑取有溶血环的菌落。用相同绵羊血琼脂平板纯化2-3次。 5.3 魏氏梭菌鉴定 5.3.1 菌株培养 从绵羊血琼脂平板上任选5 个（小于5 个全选）有溶血环的菌落，分别接种到FTG 培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。 5.3.2 形态观察 挑取菌落进行革兰氏染色，镜检观察细菌形态。魏氏梭菌为革兰氏阳性粗短杆菌，呈紫色，有时可见芽孢体。如果形态多样，表明培养液不纯，应划线接种绵羊血琼脂平板，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，挑取单个典型有溶血环的菌落接种到FTG 培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，做进一步纯化。已纯化的菌株可用于后续的生化鉴定或PCR鉴定试验。 5.3.3 牛乳汹涌发酵试验 取生长旺盛的FTG 培养液1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。魏氏梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。 5.3.4 生化鉴定 （1）硝酸盐还原—动力试验 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5 mL 试剂甲和0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。魏氏梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 （2）乳糖发酵-明胶液化试验 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，再放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，重复检查明胶是否液化。魏氏梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。 5.3.5 分子生物学（PCR）鉴定 （1）PCR模板制备 从FTG培养基中取0.5-1mL纯培养物，于灭菌的1.5mL离心管中，按细菌DNA提取试剂盒操作指南提取菌株基因组DNA，作为PCR模板。 （2）PCR反应体系配制 总体积为50μL，其中PCR Taq DNA聚合酶25μL，16S rDNA通用引物上、下游各1μL，模板1μL，dd H2O 22μL，设立阴性与阳性对照。 （3）PCR反应条件 94℃预变性 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min30s，共30个循环；72℃ 7min。扩增产物长度约为1500bp。 （4）电泳 反应结束后，将PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为：电压120V，电泳时间25min。电泳结束后，用凝胶成像仪进行成像分析。 （5）结果判定 将电泳后显示条带的PCR产物送去测序公司进行16S rRNA测序，将返回的测序结果用NCBI上的Blast进行比对分析。 5.4 菌种保存 将鉴定完毕并确认是魏氏梭菌的菌株接种于绵羊血琼脂平板上，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，将板子上的菌落全部刮下，置于含有500μL FTG的1.5mL离心管，和500μL甘油（60%）充分混匀，放入-80℃超低温冰箱保存。 七、副猪嗜血杆菌的分离与鉴定方法 1 范围 本方法规定了动物源副猪嗜血杆菌的分离与鉴定方法。 本方法适用于副猪嗜血杆菌的分离与鉴定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。 2.1 冰箱：2-4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：37±1℃。 2.3 电子天平：感量0.1g。 2.4 分析天平：感量0.1mg 2.5 恒温水浴锅：37℃～100℃ 2.6 生物安全柜 2.7 显微镜：10×～100× 2.8 PCR仪 2.9 电泳仪 2.10 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪） 2.11 微量加样器：1μL～1000μL 2.12 吸头（与微量加样器匹配） 2.13 细菌多位点接种仪 2.14 96孔板 3 培养基和试剂 标准菌株：副猪嗜血杆菌SH0165 质控菌株：胸膜肺炎放线杆菌ATCC 27090 3.1 无支原体胎牛血清。 3.2 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 3.3 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB） 3.4 Amies运送培养基 3.5 辅酶NAD 3.6 DNA Maker 2000 3.7 Taqmix DNA 聚合酶 3.8 琼脂糖 3.9 50×TAE buffer 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242g NA2EDTA.2H2O 37.2g 醋酸 57.1ml 加纯净水至 1000mL 3.10 16sRNA引物 上游引物 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’ 下游引物 5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’ 4 副猪嗜血杆菌分离与鉴定程序  图7 副猪嗜血杆菌分离鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物鼻腔拭子，或屠宰猪的完整肺脏、心包液、胸腔积液、关节液和脑脊液，置入冰盒中，保存时间不超过48小时。鼻腔拭子置于加有1%NAD的Amies运送培养基中。 5.2 副猪嗜血杆菌的分离 5.2.1 肺脏：用酒精灯火焰对肺脏表面进行消毒，用消毒的剪刀和镊子剪取一小块病灶，用内切面在加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板边缘1/4涂板，再用无菌的接种环采取三线式划法，对细菌进行划线分离培养，37℃培养36-48h；取鼻腔拭子于加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的TAS平板上三段划线，37℃培养36-48h。 5.2.2 挑取半透明、边缘光滑的可疑菌落于2.5mL加有5%胎牛血清和10μg/mL NAD的无菌TSB肉汤，37℃培养18-24h。 5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，37℃培养36h，待进一步细菌鉴定。 5.3 副猪嗜血杆菌的鉴定 5.3.1 镜检 挑取纯培养的圆形、光滑、无色透明可疑菌落涂片，革兰染色后，显微镜下观察细菌形态。副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性短杆菌，菌体大小不一。 5.3.2 卫星实验 用接种环分别挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于绵羊鲜血琼脂平板上， 再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，３７℃ 培养 ２４ ｈ～４８ ｈ，观察是否有“卫星生长”现象。 5.3.3 副猪嗜血杆菌的PCR鉴定 在纯化培养后的TSA 培养基上挑取单菌落，接入加有1% NAD 与5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中，37℃，220 r/min 摇床振荡培养18h左右。取培养后的菌液1μL做PCR鉴定，阳性对照为副猪嗜血杆菌参考株SH0165。阴性对照不加模板。根据副猪嗜血杆菌16S rRNA(M75065)序列设计引物。由金斯瑞生物技术有限公司合成，见表5-1。采取20 μL反应体系，组成成分见表5-2。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸1 min，30 个循环；最后72℃延伸10 min。 表1 副猪嗜血杆菌PCR鉴定引物序列
表2 PCR体系各组分一览表
称取1g琼脂糖，加入100mL 1×TAE 缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。 取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。电泳条件：电压110V，电泳时间30min。 结果判定：电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。如果某一待检样品扩增产物的条带与副猪嗜血杆菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为副猪嗜血杆菌。 5.4 副猪嗜血杆菌的保存 在纯化后的平板上挑取单菌落与8mL肉汤中，置于37℃摇床中培养18~24h，待菌液生长至对数期，于9000r/min，离心3分钟，弃去上清液，加入4mL灭菌的脱脂牛奶，重悬。再分装值灭菌的冻干管，每管1mL。再将分装的菌进行逐级冷冻，先后置于4℃，-20℃，-80℃至少4h以上。最后将菌液置于冻干机冻干1~2天，冻干后置于-80℃冰箱长期保存。 八、动物源伪结核棒状杆菌的分离与鉴定方法 1 范围 本标准规定了动物源伪结核棒状杆菌的分离鉴定方法。 本标准适用于脓汁中伪结核棒状杆菌的分离鉴定 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 生物安全柜 2.2 冰箱：0 ℃ ~ 4 ℃ 和 -20 ℃ 2.3 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃ 2.4 显微镜：10 ×~ 100 × 2.5 EP管:1.5 ml 2.6 采样管 2.7 采样棉拭子 2.9 微量加样器 2.10 吸头 （与微量加样器相匹配） 2.11 PCR仪 2.12 微波炉 2.13 电泳仪 2.14 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪） 3 培养基和试剂 3.1 DNA Marker 3.2 引物及扩增片段长度 PLD基因引物： 上游：CTCAAGGCGTGGATGA 下游：GGTAGCCAGATGGTGAGTAG 3.3 运送培养基 3.4 10 ％的绵羊脱纤血平板 3.5 2×Taq PCR MasterMix （含染料） 3.6 琼脂糖 3.7 50×TAE缓冲液：将242 g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA（pH 8.0），加纯水至1000 ml。 1×TAE缓冲液：临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。 3.8 溴化乙锭溶液（10㎎/ml）：称取1 g溴化乙锭溶于100 ml水中，用磁力搅拌器搅拌数小时至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。 4 伪结核棒状杆菌分离与鉴定程序  图8 伪结核板状杆菌分离鉴定程序 5 操作步骤 5.1 采样 无菌采取脓汁样品置于运送培养基中，0 ℃—4 ℃保存。 5.2分离与纯化 5.2.1 分离 将新鲜的或运送培养基中的脓汁拭子在10％绵羊脱纤血琼脂平板上涂抹，用经火焰灭菌后冷却的接种环划线。 5.2.2 培养 将上述接种后的平板置于37 ℃ 恒温培养箱中培养24h~48h。 5.2.3 纯化 观察24h和48h的血琼脂平板上的菌落形态，挑取圆形、不透明、干燥、松脆、瓷白色或淡黄色、不溶血或仅有狭窄α溶血的小菌落按5.2.2培养条件培养纯化。（革兰氏染色呈阳性小球杆菌） 5.3鉴定 5.3.1 生化鉴定 对于已纯化的菌落，可使用细菌微量生化反应管进行生化鉴定，并对照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行结果判定。 5.3.2 PCR鉴定 5.3.2.1 PCR模板的制备 用接种环从血平板上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5 ml生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心两分钟，弃上清。再加0.2ml灭菌水涡旋混匀，100℃水浴10min，12000r/min离心两分钟，取上清作为PCR模板。 5.3.2.2 PCR反应体系 根据不同厂家PCR试剂用量，配置PCR反应体系。扩增目的片段长度约758 bp. 5.3.2.3 PCR反应条件 94 ℃预变性2min，94 ℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，最后72℃终延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。 5.3.2.4 电泳 称取1.0g琼脂糖，加入100ml 1×TAE缓冲液。加热熔化后倒入水平台面的凝胶盘中，胶板厚约5 mm。依据样品数选择适宜的梳子。凝胶凝固后，放入电泳槽，于加样孔中加样，以 DL2000为对照，120v，30min 后，在溴化乙锭溶液中浸泡20min。之后于紫外凝胶成像系统或紫外投射仪中观察结果。 5.3.2.5 结果判定 如果某一待检样品扩增产物的条带与伪结核棒状杆菌阳性对照的条带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，则该样品可判定为伪结核棒状杆菌。必要时可通过16S rRNA测序进行进一步验证。 附件3—6 药敏试验检测试剂盒使用（MIC测定）操作方法 1 范围 本方法规定了动物源细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌）药敏检测试剂盒的操作方法。 2 材料 除微生物实验室常规灭菌设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱35±2℃ 2.2 生物安全柜 2.3 浊度计或者标准比浊管 2.3 微量加样器1uL~1000uL 2.4 吸头（与微量加样器匹配） 3 操作步骤 取出试剂盒，打开包装待用。 菌液制备 将无菌棉签用生理盐水润湿后，直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落，与适量无菌生理盐水混匀。然后，用标准比浊管或者浊度计校正菌液浓度至0.5麦氏单位（1~2×108CFU/mL）。最后，用试剂盒中的肉汤按照使用说明书要求的倍数稀释，混匀备用。 菌液接种 除空白对照外，其余的95孔加入制备好（用前要混匀）的菌液100µL 空白对照孔中加入100µL无菌肉汤。盖好板盖并记录菌号。 孵育 将检测板置于35℃±2℃很稳培养箱中孵育16~18小时。 观察结果 在衬有黑底板的光线下，用肉眼观察。 先观察阴性对照孔和阳性对照孔：阴性对照孔应无细菌生长，孔内液体未见浑浊；阳性对照孔内应有细菌生长所形成的圆形或者网状沉淀。 如果阴性和阳性对照结果正常，继续观察其余孔内细菌生长情况，在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。 4 结果记录 将MIC结果记录在敏感性检测结果统计表中。
敏感性检测结果统计表
（1）G-菌（大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌）MIC
养殖场： 检测员： 年 月 日
（2）G+菌（肠球菌、金黄色葡萄球菌和伪结核棒状杆菌）MIC
养殖场： 检测员： 年 月 日
（3）弯曲杆菌MIC
养殖场： 检测员： 年 月 日
（4）肠球菌和魏氏梭菌MIC（促生长抗菌药物监测）
养殖场： 检测员： 年 月 日
附件4
2020年生鲜乳质量安全监测计划
根据《乳品质量安全监督管理条例》规定，组织开展2020年生鲜乳质量安全监测计划。有关事项要求如下。一、切实履行生鲜乳质量安全监管属地责任 各级畜牧兽医（奶业）主管部门要严格按照《食品安全法》《乳品质量安全监督管理条例》《地方党政干部食品安全责任制规定》等法律法规和规范性文件的规定，根据县级以上地方人民政府对本行政区域内生鲜乳质量安全负总责，各级畜牧兽医（奶业）主管部门负监管责任，奶畜养殖者、生鲜乳收购站开办者和运输车经营者负第一责任的要求，认真落实各级责任。各省（区、市）畜牧兽医（奶业）主管部门要因地制宜制定落实本省（区、市）生鲜乳监测计划，实行收购站和运输车年度监测全覆盖，不留监管空白。 二、加强生鲜乳收购运输环节监管 各地要加强对生鲜乳收购站和运输车的监管，确保辖区内颁发证照（备案许可）的生鲜乳收购站、运输车具备法定资质条件，对于不符合条件的收购站和运输车坚决予以取缔，公开相关信息。严厉打击无证收购运输行为。跨省营运运输车，既受发证地行政机关监管，也受营运地行政机关监管。严防不合格乳流向市场。对不合格样品检测结果，承担检测任务单位要在检测结果异议处理后3个工作日内报送有关省级畜牧兽医（奶业）主管部门。严厉打击各种违法违禁添加行为，发现一起，查处一起，涉嫌刑事犯罪的，及时移送公安部门，并跟踪查处结果及时报送我部畜牧兽医局奶业处。 三、推进信息化管理，提高生鲜乳质量安全监测监管效率 各地要全面运行“全国生鲜乳收购站运输车监督管理系统”， 安排专人负责辖区内生鲜乳收购站和运输车信息核查上报工作，及时更新相关信息，准确掌握辖区内奶站、运输车和婴幼儿配方乳粉奶源基地变化情况。加强监管监测工作软硬件条件建设，全面推进《生鲜乳收购许可证》《生鲜乳准运证明》在线出证，提高管理规范化水平。开展“生鲜乳移动抽样终端”和“生鲜乳收购站运输车现场检查移动终端”应用试点，提高监管监测工作信息化、精准化水平。加快生鲜乳质量安全大数据库建设，推进信息资源整合与共享，为监管工作提供技术支撑。 四、加强组织协调，保障监管监测工作有序开展 本通知下达的生鲜乳监测任务所需经费由我部2020年生鲜乳质量安全监管财政专项经费安排。我部委托农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）承担监测任务单位的检测能力验证比对考核。各任务承担单位要根据监测工作需要，参加监测技术培训，完善仪器设备配置，提高监测结果的科学性和准确性。各省（区、市）畜牧兽医（奶业）行政主管部门要高度重视生鲜乳质量安全监测工作，切实加强组织领导，协调处理好各方面关系，保质保量完成监测任务，请于2020年4月25日前将本省2020年生鲜乳质量安全监测计划报我部畜牧兽医局奶业处备案。 联系方式 农业农村部畜牧兽医局奶业处 电话：010-59191536/46 传真：010-59191533 电子邮件：nzzd@agri.gov.cn 有关《生鲜乳质量安全监测系统》《生鲜乳收购站运输车监督管理系统》和“生鲜乳移动抽样终端”的使用联系中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 电话：010-62160212 传真：010-62160213 电子邮件：67513193 @qq.com 附件：4—1. 2020年生鲜乳质量安全监测计划名录 4—2. 2020年生鲜乳质量安全监督抽查计划名录 4—3. 农业农村部生鲜乳质量安全监测工作规范 附件4—1
2020年全国生鲜乳例行监测计划分配表
附表4—2
2020年婴幼儿配方乳粉奶源质量安全监测计划分配表
附表4—3
2020年生鲜乳质量安全飞行抽检计划分配表
(责任编辑：admin) |
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农业农村部关于印发2020年饲料兽药生鲜乳质量安全监测计划的通知
时间:2020-05-15 15:18来源:农业农村部网站 作者:admin 点击:
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